Hamowanie helikazy SARS-CoV-2 przez pojedyncze uszkodzenia DNA

Genom SARS-CoV-2 koduje kilka niestrukturalnych białek (NSP) zaangażowanych w replikację i rozprzestrzenianie się wirusa, przy czym wiadomo, że NSP13 odgrywa rolę w dekodowaniu RNA i późniejszej transkrypcji jednoniciowej matrycy.

Stado: Zmienne hamowanie szybkości odwijania DNA katalizowanego przez helikę nsp13 SARS-Cov-2 (COV19) przez strukturalnie odrębne pojedyncze uszkodzenia DNA.. Źródło zdjęcia: Limbitech / Shutterstock

Helikazy NSP13 mogą być hamowane przez zapobieganie interakcji z docelowym DNA. Na arkuszu ostatnio przesłanym na serwer prepress bioRxiv* badany jest wpływ określonych zmian DNA na aktywność zmiatania NSP13.

Jak przeprowadzono badanie?

Koniec 3′ substratu oligonukleotydowego oznaczono przerywnikiem fluorescencyjnym, podczas gdy koniec 5′ przeciwległej nici oznaczono fluoroforem. Dlatego też intensywność fluorescencji była wprost proporcjonalna do zastosowanej aktywności helikazy NSP13, ponieważ dysocjacja oligonukleotydu zatrzymała wygaszanie fluorescencji.

Specyficzne uszkodzenia DNA wygenerowano na podłożu oligonukleotydowym, a następnie zidentyfikowano i oddzielono za pomocą spektroskopii NMR i wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Dwa rodzaje badanych zmian zostały wywołane przez ekspozycję na promieniowanie UV: zmiany guaninowe, które wytwarzały albo. przez lub Wspólnota Niepodległych Państw stereoizomery.

Co znalazło badanie?

Zaobserwowano, że wszystkie cztery typy uszkodzeń DNA powodowały poważną utratę aktywności rozprzęgania przez NSP13, przy czym obserwowane tempo odwijania było 20–100 razy wolniejsze niż w przypadku niezmodyfikowanego DNA. W niezmodyfikowanym DNA, początkowy wybuch aktywności rozwijania występuje z powodu szybkiego rozwijania istniejących wcześniej ugrupowań NSP13-DNA, spowalniając, ponieważ późniejsze tworzenie kompleksu staje się czynnikiem ograniczającym. Taka aktywność blastyczna nie była obserwowana dla zmian zawierających DNA. Następnie grupa zbadała, czy zmiany hamują kompleks NSP13-DNA, czy tylko jego późniejszą aktywność.

przezDNA ma nienaruszone parowanie zasad i prawie normalny szkielet Wspólnota Niepodległych PaństwDNA jest wyraźnie zniekształcone wokół miejsca uszkodzenia. W rezultacie NSP13 może lepiej wchodzić w interakcje z przezDNA, zaobserwowano znacznie większą aktywność oczyszczającą. NSP13 tworzy wąski kanał, przez który musi przejść nić transportowa, a dodatkowa przeszkoda steryczna tworzona przez Wspólnota Niepodległych PaństwStwierdzono, że DNA spowalnia tempo rozpadu. Podobnie DNA niosące mniej masywne zmiany CPD i 6-4PP rozluźnia się 2-5 razy szybciej niż Wspólnota Niepodległych Państw lub przez zmiana patologiczna.

Uszkodzenie CPD charakteryzuje się sieciowaniem kowalencyjnym, podczas gdy 6-4PP zawiera tylko jedno wiązanie kowalencyjne, ale generalnie zniekształca szkielet DNA. Ponownie, to bezpośrednio przekłada się na wolniejsze tempo odwijania za pośrednictwem NSP13 6-4PP DNA CPD przenoszącego zmiany.

Autorzy zauważają, że sposób, w jaki DNA przenosi mniejsze zmiany CPD, 6-4PP lub większe powinowactwo do guaniny, różni się nie tylko szybkością, ale także charakterem, przy czym szybkość zmienia się w czasie. Zmiany DNA niosące CPD lub 6-4PP były eluowane przez NSP13 w sposób nieliniowy do uzyskania wydajności 25–35%, w którym to momencie tempo odwijania ustabilizowało się. I odwrotnie, tempo odwijania rosło wolniej w sposób liniowy w czasie dla tolerancji DNA Wspólnota Niepodległych Państw lub przez Guanina zbliża się do co najmniej 35% i prawdopodobnie ją przekroczy.

*Ważna uwaga

bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie podlegają wzajemnej ocenie, a zatem nie powinny być uważane za rozstrzygające, ukierunkowywać praktykę kliniczną/zachowania związane ze zdrowiem lub być traktowane jako ustalone informacje.