Daeshiho-tang osłabia odpowiedź zapalną i stres oksydacyjny w makrofagach stymulowanych LPS poprzez regulację szlaków TLR4/MyD88, NF-κB, MAPK i Nrf2/HO-1.

Materiał

Zakupiono następujące materiały do ​​badań: pożywkę Eagle’a modyfikowaną Dulbecco (DMEM), płodową surowicę bydlęcą (FBS), penicylinę i streptomycynę (P/S) od Gibco BRL (Grand Island, NY, USA); odzież (Escherichia coli; O111:B4); L-NMMA, indometacyna i bufor do lizy do testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) z Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA); CCK-8 firmy Dogendo (Kumamoto, Japonia); Odczynnik Grace’a z firmy Promega (Madison, WI, USA); Grupa przeciwutleniająca oparta na kwasie 2,2′-azyno-bis-3-etylobenzotiozolino-6-sulfonowym (ABTS) i PGE.₂ zestaw do wykrywania immunoenzymatycznego testu ELISA z Cayman Island (Ann Arbor, MI, USA); Pierwotne przeciwciała z Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) przeciwko iNOS (#13120), COX-2, NF-κB p65, IκBα, fosfo-p38 (Thr180/Tyr182), p38, fosfo-ERK (Thr202)./ Tyr204), ERK, fosfo-JNK (Thr183/Tyr185), JNK, β-aktyna, GAPDH, Lamin B1, MyD88, Nrf2, HO-1 i TLR4 z Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Teksas, USA); Przeciwciała wtórne przeciw króliczym i mysim sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) z Jackson ImmunoResearch (West Grove, Pensylwania, USA); Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy oraz odczynniki do ekstrakcji jądrowej i cytoplazmatycznej NE-PER firmy Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA); Chemiluminescencja ECL z GE Healthcare (Chicago, IL, USA). Membrana z polifluorku winylidenu firmy Millipore (Kenilworth, New Jersey, USA).

Przygotuj ekstrakt DSHT

Ekstrakt DSHT przygotowano z wodą i przeprowadzono analizę fitochemiczną według Seo i Shina³⁰. W skrócie, suszone leki ziołowe posiekano, zmieszano, a następnie ekstrahowano w temperaturze 100°C przez 2 godziny przy użyciu ekstraktora COSMOS-660 (Kyungseo E&P, Incheon, Korea) zgodnie z Pangyakhapion²⁰. Odwar DSHT przefiltrowano przez sito 53 μm, liofilizowano za pomocą PVTFD100R (IlShinBioBase, Dongducheon, Korea) i przechowywano w temperaturze -18°C w zielniku KM Science Research Department, Korea Institute of Oriental Medicine (Wzór kuponu nr KE61). ) do czasu użycia. Ilość albifluranu (nr CAS 39011-90-0), bajkaleiny (nr CAS 491-67-8), bajkaleiny (nr CAS 21967-41-9) i kwasu benzoesowego (nr CAS 65-85) – 0), kwas galusowy (nr CAS 149-91-7), naringina (nr CAS 10236-47-2), paeuniflorina (nr CAS 23180-57-6), ponseryna (nr CAS 14941-08-3 ), wogonina (nr CAS 632-85-9), wogonozyd (nr CAS 51059-44-0) w ekstrakcie DSHT wynosiły 1,5, 3,78, 45,98, 0,96, 2,62, 5,04, 7,74, 7,55, 0,77 i 8,34 mg . /g odpowiednio³⁰.

Ocena hodowli i morfologii komórek

Komórki RAW 264.7 (makrofagi szczurów) pochodziły z American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Makrofagi inkubowano w DMEM uzupełnionym 5,5% FBS i 1% P/S i hodowano w temperaturze 37°C w komorze wilgotnej zawierającej 5% CO2.₂. Zmianę morfologiczną DSHT obserwowano w komórkach stymulowanych LPS (1 µg/ml) lub bez niego przez 18 godzin i badano za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym (×200) (Olympus, Tokio, Japonia).

Test proliferacji komórek

Komórki (1 x 10⁴ Komórki/studzienkę) wysiano na przezroczystą 96-studzienkową płytkę i hodowano przez noc. Następnego dnia komórki poddano działaniu różnych stężeń DSHT (12,5–400 µg/ml) i inkubowano przez dodatkowe 24 godziny. W celu określenia proliferacji komórek zastosowano zestaw CCK-8 zgodnie z instrukcjami producenta. Absorbancję odczytano przy 450 nm przy użyciu czytnika płytek (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia, USA), a proliferację komórek wyrażono za pomocą następującego równania:

Określ NIE i PGE₂

Komórki (7,5 x 10⁴ Komórki/studzienkę) wysiano na przezroczystą 48-studzienkową płytkę i wystawiono na działanie DSHT (25–400 µg/ml), L-NMMA (100 µM) i indometacyny (5,6 nM) z lub bez LPS (1 µg) lub bez. . /ml) i inkubować przez dodatkowe 24 godziny. Syntezę NO oznaczono za pomocą odczynników Griessa. Obejmuje to zmieszanie 50 µl supernatantu hodowli komórkowej z roztworem sulfanilamidu i pozostawienie mieszaniny do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie do komórek dodano dichlorowodorek naftyloetylenodiaminy (NED), inkubowano przez 10 minut i zmierzono absorbancję przy 540 nm przy użyciu czytnika mikropłytek (Bio-rad). Do określenia stężenia azotynów wykorzystano krzywą standardową azotynu sodu. Komercyjna PGE₂ Do weryfikacji PGE wykorzystano zestaw ELISA₂ Wypoziomuj, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Western blotting

Ekstrakty z całych komórek otrzymano przy użyciu buforu RIPA, koktajlu inhibitorów proteazy i fosfatazy oraz buforu PMSF. Zastosowano zestaw do ekstrakcji cytozolu i jądra, zgodnie z procedurami producenta, w celu otrzymania cytozolu (CE) i ekstraktu jądrowego (NE). Do wykrywania ekspresji białek iNOS, COX-2, NF-κB p65, IκBα, fosfo-p38, p38, fosfo-ERK, ERK, fosfo-JNK, JNK, Nrf2, HO-1, MyD88, TLR4 i β- aktynę, GAPDH, Lamin B1 i elektroforezę przeprowadzono w celu oddzielenia 20 µg ekstraktów z całych komórek, CE i NE, które następnie przeniesiono na membranę PVDF. Błony blokowano 5% roztworem odtłuszczonego mleka przez 1 godzinę, a następnie inkubowano z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym w temperaturze 4°C przez noc. Po związaniu przeciwciała pierwotnego błony inkubowano z wtórnymi przeciwciałami kozimi przeciw króliczym IgG-HRP i kozimi przeciw mysim IgG-HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej; Białka wykrywano metodą chemiluminescencji ECL i wywoływano przy użyciu instrumentu Chemi-Doc (Bio-rad). Ekspresję białka oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania Image J 1.53 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Oryginalne obrazy Western blot stanowią informacje uzupełniające dostępne w tym artykule online.

Aktywność wychwytywania rodników ABCS

Zdolność DSHT do zapobiegania utlenianiu ABTS porównano z Troloxem jako kontrolą pozytywną. Absorbancję mierzono przy długości fali 750 nm. Każde badanie przeprowadzono przy użyciu świeżo przygotowanego roztworu ABTS zgodnie z instrukcją producenta.

Analiza statystyczna

Spójne wyniki uzyskano przeprowadzając eksperymenty co najmniej trzy lub cztery razy. Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Do określenia istotności statystycznej wykorzystano test t-Studenta. SWartość mniejszą niż 0,05 uważa się za istotną statystycznie.