Odkryto nowy typ RNA, który hamuje szeroką gamę infekcji wirusowych

RNA jest często opisywany jako jednoniciowy kuzyn DNA, dwuniciowej cząsteczki, która tworzy genomy wszystkich żywych istot. Jednak wiele typów nieżywych wirusów przenosi swoją informację genetyczną w postaci dwuniciowego RNA (dsRNA). Kiedy ludzki układ odpornościowy wykryje obecność tego obcego RNA, uruchamia alarm, zwiększając produkcję ochronnej cytokiny zwanej interferonem (IFN), która aktywuje wrodzoną odpowiedź immunologiczną przeciwko najeźdźcom wirusowym.

Naukowcy próbowali wykorzystać tę naturalną odpowiedź przeciwwirusową, tworząc terapeutyczne RNA, które naśladuje cechy genomu wirusa. Ale zakłócanie wrodzonego układu odpornościowego to miecz obosieczny. Wirusowe analogi RNA mogą również aktywować szlaki molekularne, które prowadzą do nadmiernego stanu zapalnego w organizmie, potencjalnie powodując więcej szkód niż korzyści przeciwwirusowe.

Teraz grupa naukowców z Harvard’s Wyss Institute for Bioinspired Engineering odkryła nową klasę immunostymulujących dsRNA, które stymulują wytwarzanie dwóch form IFN (IFN-I i IFN-III), jednocześnie zmniejszając często obserwowany stan zapalny. Z poprzednimi typami immunostymulatorów opartych na RNA.

Cząsteczki dsRNA znacząco ograniczają zdolność kilku wirusów o potencjale pandemicznym — w tym SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV i wielu szczepów grypy typu A — do infekowania komórek ludzkich, zarówno w konwencjonalnej hodowli komórkowej, jak i w modelach Kompleks do usuwania narządów ludzkich z płuc. W mysim modelu COVID-19 tRNA zmniejszyło ilość wirusa w ciałach zwierząt ponad 1000-krotnie. Wyniki zostały opublikowane w dniu dzisiejszym w Molecular Therapy – Nucleic Acids.

Ten nowy RNA jest atrakcyjną opcją terapeutyczną dla COVID-19, ponieważ infekcja SARS-CoV-2 wywołuje niezrównoważoną odpowiedź immunologiczną, w której ochronna reakcja IFN jest tłumiona, podczas gdy reakcja zapalna jest podwyższona. Poprzez preferencyjne zwiększanie IFN-I, nasze dsRNA ma potencjał do korygowania tej nierównowagi i może być również stosowane w leczeniu wielu innych chorób wirusowych”, który jest obecnie dyrektorem ds. Rozwoju Przedklinicznego w Xellar Biosystems.

Odkrycie zbiegu okoliczności, systematyczne szpiegostwo

Przez lata Bey i inni członkowie laboratorium Wyss, dyrektora założyciela Dona Ingbera, opracowali nowe metody leczenia chorób wirusowych, wykorzystując platformę ludzkich narządów. Przed 2020 r. zespół pracował nad zidentyfikowaniem genów w ludzkich komórkach płuc, które regulują ich reakcje na zakażenie grypą A, która w tamtym czasie była wirusem wzbudzającym największe obawy związane z pandemią. Zaczęli od użycia testu CRISPR-Cas9 do identyfikacji genów gospodarza, które mogą hamować rozprzestrzenianie się wirusa grypy. Jednym z największych kandydatów w badaniach przesiewowych był gen o nazwie DGCR5, który zamiast białka wytwarza długą niekodującą sekwencję RNA. Aby zobaczyć, jak DGCR5 wpływa na wskaźniki infekcji, „zniszczyli” gen, projektując trzy różne małe interferujące dwuniciowe RNA (siRNA), które zakłócają ekspresję genu, a następnie dostarczyli siRNA do hodowanych komórek płuc.

Naukowcy odkryli, że ta kombinacja obniżyła poziom DGCR5 o ponad 80% i zahamowała infekcję grypy A o ponad 90%. Zmotywowani tymi odkryciami rozpoczęli indywidualne testowanie siRNA, a także niektórych dodatkowych sekwencji siRNA specyficznych dla DGCR5. Ku ich zaskoczeniu, podczas gdy dziewięć z dziesięciu siRNA, które wygenerowały znacznie zmniejszoną ekspresję genu DGCR5, tylko jeden z nich powstrzymał infekcję wirusową. Wydaje się, że aktywność DGCR5 może nie być motorem wskaźników infekcji wirusowych.

Kiedy dalej badali, potwierdzili, że ten konkretny mały mRNA indukował regulację w górę wielu genów zaangażowanych w szlak sygnałowy IFN. Dodatkowe badania wykazały, że siRNA aktywowało wyłącznie jeden z trzech szlaków sygnałowych, które mogą prowadzić do wytwarzania IFN, znanego jako szlak RIG-I, istotnego składnika wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Naukowcy zaczynają podejrzewać, że odkryli nową klasę dsRNA, która stymuluje układ odpornościowy poprzez nieznany wcześniej mechanizm działania.

Systematycznie wygenerowali i przetestowali ponad 200 odmian oryginalnej sekwencji tRNA, aby wywołać ten mechanizm. Zidentyfikowali specyficzny łańcuch nukleotydów, zwany „motywem”, który był stale obecny na jednym końcu dsRNA o działaniu stymulującym IFN: cytozyna (C) na jednej nici i trzy guaniny (GGG) na drugiej. Ponieważ C wiąże się z jednym G sekwencji GGG na figurze, na końcu każdego dsRNA znajduje się „nakładka” dwóch G. Gdy obecnych jest wiele kopii dsRNA, wystające G jednej cząsteczki może wiązać się z inną cząsteczką poprzez niezwykłe zjawisko zwane parowaniem zasad GG Hoogsteena. Powstałe dimery dsRNA następnie bardzo skutecznie wiążą się bezpośrednio z RIG-I, powodując jego aktywację, a następnie odpowiedź IFN.

„Było to dla nas bardzo interesujące, ponieważ poprzednie badania wykazały, że RIG-I może być aktywowany przez 'tępe’ dupleksowe dsRNA, które nie mają wypustek, i że prawie każdy gatunek może hamować wiązanie RIG-I. Ale unikalne zachowanie wiązania z GG, które mamy zaobserwowali, że skutecznie tworzy tępo zakończone dsRNA, które mogą skutecznie aktywować RIG-I, więc w tym przypadku nakładanie się jest kluczowe dla aktywności naszego nowego dsRNA”. MD, były stypendysta ds. rozwoju technologii w Wyss, a obecnie profesor w Instytucie Zaawansowanych Technologii w Shenzhen w Chinach.

Od grypy do COVID i nie tylko

Aby zobaczyć, jak skuteczne są nowo odkryte dsRNA w żywych komórkach, naukowcy przetestowali jeden z nich przeciwko syntetycznemu stymulatorowi odporności, który naśladuje infekcje wirusowe zwane poli(I:C). Kiedy zastosowali te dwie terapie do ludzkich komórek nabłonkowych, odkryli, że dsRNA wytwarza mniej zapalnej odpowiedzi przeciwwirusowej, podczas gdy zapalny poli(I:C) powodował znacznie szersze zmiany w ekspresji genów i wpływał na inne procesy biologiczne niezbędne do normalnego funkcjonowania. funkcja komórki.

Idąc o krok dalej, zespół przetestował następnie dsRNA w ludzkich drogach oddechowych i wycinkach pęcherzyków płucnych opracowanych wcześniej w Instytucie Wyssa w celu replikacji złożonych ludzkich tkanek i fizjologii w laboratorium. Wprowadzili dsRNA do zdrowych chipów i zauważyli, że ekspresja IFN-I wzrosła 12-40-krotnie. Kiedy następnie dodali wirus grypy A do chipów narządów, odkryli, że dsRNA hamuje infekcję o 80-90%.

Następnie wybuchła pandemia COVID-19, a zespół skierował swoje badania od grypy do SARS-CoV-2 i pokrewnych koronawirusów SARS-CoV i MERS-CoV oraz wirusa przeziębienia HCoV-NL63. Ich dupleksowe RNA (dsRNA) zmieniło etap, hamując infekcję MERS-CoV i HCoV-NL63 w linii komórek ssaków pochodzących od małpy o ponad 90%, a SARS-CoV ponad 1000-krotnie. Zapobiegał również infekcji linii ludzkich komórek nabłonkowych SARS-CoV-2 w zdumiewającym 99,99%.

Badania te zostały ukończone we współpracy z grupą Matthew Freemana z University of Maryland School of Medicine i Benjamina Ten z Icahn School of Medicine w Mount Sinai (obecnie NYU Grossman School of Medicine).

Na koniec przetestowali dsRNA w mysim modelu COVID-19 ze współpracownikami Dong Yang i Colleen Johnsson, PhD. w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee. Kiedy zainfekowali myszy traktowane SARS-CoV-2, tRNA zmniejszyło obciążenie wirusem w płucach zwierząt ponad 1000 razy w porównaniu do zwierząt leczonych sekwencjonowaniem mieszanego tRNA.

„Pandemia COVID-19 jasno pokazała, że ​​potrzebujemy terapii na dużą skalę zdolnych do osłabienia infekcji przez szeroką gamę wirusów, zamiast opracowywania spersonalizowanego leczenia dla każdej choroby, gdy się ona pojawia. Mam nadzieję, że ta technologia terapeutyczna RNA, której chemikalia właściwości sprawiają, że jest łatwy w produkcji na dużą skalę, fizyka jest szeroko stosowanym podejściem do walki z przyszłymi epidemiami” – powiedział dr Don Ingber, który jest również profesorem biologii naczyń Yoda Folkmann w Harvard Medical School (HMS) i Boston Children’s Hospital oraz Hansjörg Wyss profesor bioinżynierii w Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.

Oprócz leczenia wirusów, te nowe złogi mogą leczyć infekcje bakteryjne, grzybicze i pasożytnicze, a także stany takie jak rak i choroby autoimmunologiczne, które mogą korzystać ze zwiększonej produkcji interferonu. Może być również stosowany jako dodatek wzmacniający działanie innych szczepionek.

Autorzy twierdzą, że dla przyszłych badań ważne jest określenie optymalnego terminu leczenia, ponieważ zbyt późna aktywacja IFN w infekcji może nasilać stan zapalny, a także zbadanie możliwości podania dsRNA bezpośrednio do górnych dróg oddechowych (np. za pomocą inhalatora). w celu zmniejszenia aktywacji dsRNA bezpośrednio do górnych dróg oddechowych układ odpornościowy.

Dodatkowymi autorami artykułu są członkowie Wyss Institute Amanda Jiang, Chaitra Belgur, Kenneth Carlson, Fan Hong i Karina Calderon; byli członkowie Wyss Institute Crystal Oh, Ateeq Noorani, Wuji Kao i Rachel Brantel-Bowen; Yongxin Ye, Tian Zhang i Steven Gygi z HMS; Tristan Jordan z Icahn School of Medicine na górze Synaj. James Log, Marisa McGrath i Matthew Freeman ze Szkoły Medycznej Uniwersytetu Maryland; Dong Yang i Colin Johnson z Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Tennessee; oraz Benjamin Tenn z Grossman School of Medicine na Uniwersytecie Nowojorskim.

Badania te były wspierane przez Narodowy Instytut Zdrowia w ramach NCATS UH3-HL-141797 oraz Agencję Zaawansowanych Projektów Badawczych Obrony na podstawie umów o współpracy HR00111920008 i HR0011-20-2-0040.