Naukowcy opracowują nową metodę mapowania przestrzennej ewolucji nowotworów

W niedawnym badaniu opublikowanym w charakter temperamentuNaukowcy opracowali przepływ pracy dla klonalnego mapowania genetycznego skoncentrowany wokół określonej zasady Na miejscu Technika sekwencjonowania (BaSISS) umożliwiająca uzyskanie map ilościowych wielu kopii genetycznych komórek rakowych.

tło

Komórki rakowe lub nowotworowe to dynamiczne jednostki, które nieustannie się zmieniają i przekształcają swoje interakcje z mikrośrodowiskiem. Komórki te zawierają wiele gorszych grup, które są grupami komórek genetycznie spokrewnionych, ale odrębnych.

Techniki genomiczne, takie jak sekwencjonowanie całego genomu (WGS), pozwoliły odkryć subklony, ale wydają się niewystarczające do odszyfrowania ich cech fenotypowych i interakcji w ekosystemach tkankowych. Jest to główne ograniczenie, ponieważ wszystkie cechy podkomórek nowotworowych są determinantami wzrostu raka, progresji, nawrotu lub niekorzystnych wyników.

Przepływ pracy w Basiss

Program BaSISS był skierowany do podrodzin zidentyfikowanych przez drzewo filogenetyczne pochodzące z WGS. Specyficzne dla mutantów sondy blokujące BaSISS poddano najpierw hybrydyzacji z komplementarnym DNA (cDNA) zmutowanych i typu dzikiego alleli wariantów somatycznych specyficznych dla transkryptomu. Na miejscu. Wszystkie sondy blokujące komplementarne do celu były w pełni sprzężone i utworzono zamknięte obwody.

Następnie, znakowane fluoroforem badanie i cykliczna mikroskopia jednoznacznie wykryły czytnik o długości od czterech do pięciu nukleotydów z uwiązanych sond amplifikowanych przez amplifikację obwodu krążącego, umożliwiając multipleksację. Zespół wykorzystał modelowanie matematyczne do wygenerowania map klonów przy użyciu sygnałów BaSISS i sklonowanych genotypów.

o nauce

W tym badaniu naukowcy pobrali osiem mas tkankowych od dwóch pacjentów (P1 i P2), którzy przeszli chirurgiczną mastektomię z powodu wieloogniskowego raka piersi. Te próbki tkanek obejmowały trzy histologiczne etapy wczesnej progresji raka: rak przewodowy Na miejscu (DCIS), rak inwazyjny i przerzuty do węzłów chłonnych.

W trzech próbkach receptora P1, P1-estrogenowego (ER) 1, P1-ER2 i P1-D1, eksperymenty WGS zidentyfikowały grupy mutacji związane z sześcioma gałęziami drzewa filogenetycznego. Sondy blokujące BaSISS namierzyły 51 alleli na każdej gałęzi drzewa filogenetycznego. Zespół zidentyfikował podklon na podstawie identyfikatora pacjenta i odpowiadającego mu koloru węzła drzewa filogenetycznego.

Warto zauważyć, że różne kolory wskazane w P1 oznaczają sęki. Na przykład P1-fioletowy, P1-czerwony, P1-szary, P1-pomarańczowy, P1-zielony i P1-niebieski. Podobnie genotyp subklonowy składa się z mutacji subklonalnych, które kumulują się, gdy jedna z nich przemieszcza się z korzenia drzewa do węzła subklonu. Na przykład P1-green ma szare, niebieskie i zielone kolce gałęzi.

Zespół zbadał trzy próbki pierwotnego raka piersi (PBC) z mieszaną tkanką inwazyjną i DCIS: P1-ER1, P1-ER2 i P2-potrójnie ujemny (TN) 1, aby wykazać, że BaSISS może mapować różne etapy progresji raka w całej tkance sekcje. Ponadto naukowcy połączyli dane przestrzenne, aby określić, w jaki sposób zmiany fenotypowe odnoszą się do statusu genetycznego i zmian statusu histologicznego.

Wiadomo, że DCIS jest genetycznie heterogeniczny, ale sposób, w jaki DCIS jest zorganizowany i rozmnażany przez szerszy system kanałów, pozostaje słabo poznany. Zespół zbadał więc trzy próbki DCIS z P1 (P1-D1, P1-D2 i P1-D3), które obejmowały powierzchnię tkanki 224 mm.². Na koniec zespół przeprowadził analizę przestrzennej ekspresji genów przy użyciu celu Na miejscu sekwencjonowanie (ISS).

Wyniki

Około 97% wykrytych sygnałów pozycyjnych BaSISS zostało przekształconych w zrozumiałe kody kreskowe. Ich średni zasięg na cel był 13 000 razy większy niż na 300 mm² tkanki piersi. Co więcej, frakcje wariantów alleli pochodzące z BaSISS wykazały silną korelację między powtórzonymi eksperymentami na seryjnych przekrojach tkanek, ujawniając ich odtwarzalność ilościową. Barwne sygnały BaSISS zgodnie z subklonalną gałęzią mutacji ujawniły wizualny wgląd w strukturę wzrostu subklonalnego.

Algorytm mapowania klonów dostosował również obserwowane częstości alleli do zestawu błędów metodologicznych (np. różnicowa czułość sondy BaSISS). Jednak częstości modelowanych alleli BaSISS były wysoce zgodne z danymi walidacyjnymi wychwytywania laserowego (LCM)-WGS.

Zgodnie z połączonymi danymi WGS, BaSISS wykrył dwa do czterech subklonów dla każdego PBC. Badanie ilościowe wykazało, że poszczególne subklony tworzyły przestrzenne wzorce związane z progresją histologiczną przypadków nowotworowych. Na przykład w P1-ER2 region amplifikacji był genetycznie niezwiązany z rakiem, co potwierdził LCM-WGS. W każdym PBC modele progresji genetycznej i histologicznej były w dużej mierze stabilne. Raki inwazyjne składały się głównie z komórek z najnowszych zróżnicowanych subklonów.

Odwrotnie, poprzednie rozbieżne klony były całkowicie lub częściowo zlokalizowane w DCIS. Jednak jeden subklon w każdym PBC obejmował zarówno tkanki inwazyjne, jak i DCIS. Zauważył, że mogą również istnieć oddzielne przypadki postępu histologicznego i genetycznego. Przykłady obejmują klon P1-czerwony w P1-ER1 i klon P1-fioletowy w P1-ER2.

Odnośnie zmian fenotypowych towarzyszących inwazji raka, autorzy zauważyli, że regiony klonalne homozygotyczne (PTEN) fosfatazy i tensyny wykazywały bardziej intensywne barwienie jądrowe metodą immunohistochemii Ki-67 (IHC) niż regiony typu dzikiego. Regulacja w górę Ki-67, innego klonu genetycznego, była czasowo związana z nabyciem mutacji PTEN i przed inwazją.

Komórki nabłonka pomarańczowego P1 wykazywały wyższą ekspresję onkogenów regulujących cykl komórkowy cykliny D1 (CCND1), cykliny B1 (CCNB1) i onkogenu białka palca cynkowego 3 (ZNF703), które powiązano z niekorzystnymi wynikami klinicznymi. Ogólnie, profile ekspresji architektonicznej, jądrowej i genowej były w znacznym stopniu specyficzne dla linii, a ich przestrzennie różne wzorce również można było zwizualizować.

Analiza próbki P2-LN1 przy użyciu BaSISS ujawniła dwa transkrypty (P2-niebieski i P2-pomarańczowy), które utworzyły przestrzennie odrębne wzory. Adnotacja histologiczna z hematoksyliną i eozyną (H&E), wspólne limfocyty Plamy antygenowe (CD45) i pancytokeratynowe zidentyfikowały wiele wzorców wzrostu raka przerzutowego. Autorzy zauważają silne powiązania między tymi dwoma wykrytymi klonami i ich histologicznymi wzorcami wzrostu.

Podsumowując, BaSISS jest cennym dodatkiem do zestawu narzędzi do omiki przestrzennej z jego niezwykłą zdolnością do przestrzennego lokalizowania, a nawet charakteryzowania wielu subklonów nowotworowych. W przyszłości jego szerokie zastosowanie może pomóc w ujawnieniu, w jaki sposób nowotwory rozwijają się w różnych tkankach, co z kolei może pomóc w śledzeniu złowrogich subklonów, które powodują negatywne wyniki kliniczne.