SARS-CoV-2 Jakościowa zmienna reakcja łańcuchowa polimerazy do nadzoru genetycznego SARS-CoV-2

Przeglądanie statusu rozmowy opublikowanej w dniu pole wyszukiwania* Serwer Prepress, naukowcy zgłosili błędną klasyfikację wariantu ostrego zespołu ostrego układu oddechowego koronawirusa 2 (SARS-CoV-2) Omicron BA.1 jako wariantu Omicron BA.2 w analizie specyficznej dla wariantu automatycznej reakcji łańcuchowej polimerazy (vsPCR).

Śledzenie wariantów ma kluczowe znaczenie dla nadzoru genetycznego SARS-CoV-2. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest często stosowaną techniką identyfikacji wariantów, jest czasochłonne i nieopłacalne. Test vsPCR jest szybszą i tańszą metodą wykrywania mutacji specyficznych dla wariantu i jest zależny od amplifikacji (w przypadku mutacji) lub specyficznych pików w temperaturach topnienia, które występują po amplifikacji.

O raporcie o stanie

Przedstawiając obecny przypadek, autorzy zgłaszają błędną interpretację Omicron BA.1 znalezionego jako Omicron BA.2 w analizie vsPCR z powodu mutacji punktowej.

Kwas rybonukleinowy (RNA) SARS-CoV-2 został wyekstrahowany od pacjentów z chorobą koronawirusową 2019 (COVID-19) za pomocą testów NGS i vsPCR. Analizy bioinformatyczne przeprowadzono przy użyciu dedykowanego rurociągu i ultraszybkiego umieszczania próbek na istniejących drzewach (UShER) w celu identyfikacji wariantów SARS-CoV-2.

Stwierdzono rozbieżność w wynikach analiz NGS i vsPCR w marcu 2022 r. dla 17 próbek COVID-19 z Vigo w Hiszpanii. Klaster Omicron BA.1.1.14 wykazywał podobny wzorzec temperatury topnienia jak Omicron BA.2 ze względu na obecność dwóch zasad dla mutacji punktowej C21772T poniżej delecji aminokwasu białkowego SARS-CoV-2(S). 69/70 (oznaczony jako 69/70del).

69/70del jest szeroko stosowany do różnicowania Omicron BA.1 (delecja dodatnia 69/70) i ​​Omicron BA.2 (delecja ujemna 69/70) metodą vsPCR Tak więc mutacja C21772T może powodować błędną interpretację Omicron BA. 1 wariant jako wariant Omicron BA.2. Ponad tysiąc sekwencji Omicron BA.1 zawartych w Global Initiative to Share All Influenza Data (GISAID) nosi mutację C21772T. W taki sposób, w jaki delecja 69/70 powoduje niepowodzenie docelowego genu S (SGTF), nowe mutacje mogą powodować niepowodzenia w analizie opartej na PCR.

Zespół przeprowadził wielokrotne dopasowanie i analizę drzewa filogenetycznego, aby potwierdzić, że próbki zakażone SARS-CoV-2 były monofiletyczne, a po dopasowaniu ze szczepem Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2 (używanym jako odniesienie), niektóre niewłaściwie umiejscowione pominięty. Usunięto kodon 69/70. Dlatego mutacja została oznaczona jako A21766T (nie C21772T) w bazach danych Nextclade i CoVSpectrum.

17 próbek COVID-19 poddano testom Haina i drugiej analizie vsPCR w celu ponownego przetestowania, po czym uzyskano te same wyniki z interpretacją wariantu Omicron BA.2. Po śledzeniu kontaktów znaleziono 10 sekwencji związanych z uczniami szkół średnich, a cztery próbki były powiązane epidemiologicznie.

Mutacja A67V (C21762T) przed delecją 69/70 jest zwykle obecna w wariantach Omicron BA.1. Autorzy zasugerowali, że mutacja punktowa C21772T zapobiega identyfikacji delecji kodonu 69/70 i że delecja kodonu 69/70 powoduje utratę aminokwasów waliny (V) i histydyny (H). Biorąc pod uwagę, że adenina (A)-tymina (T)-cytozyna (C), ATT i ATA wszystkie przekształcają się w izoleucynę (I), mutacja C21772T nie spowodowała podstawień w sekwencji aminokwasowej.

wniosek

Podsumowując, wyniki przypadków wykazały błędną klasyfikację wariantu Omicron BA.1 jako podzmiennej Omicron BA.2 z powodu mutacji punktowej, która znajdowała się dwie zasady azotowe poniżej delecji 69/70 w analizie PCR specyficznej dla wariantu. Autorzy uważają, że opis przypadku jest pierwszym, który zgłosił mutację C21772T powodującą negatywne wyniki w analizie vsPCR ukierunkowanej na delecję 69/70. Raport wskazuje, że mutacje w obiektach docelowych testów vsPCR opartych na krzywej topnienia mogą powodować błędną klasyfikację wariantu SARS-CoV-2, a zatem potwierdzenie wyników testu vsPCR przez NGS może zwiększyć dokładność nadzoru genetycznego SARS-CoV-2.

Kilka testów opartych na krzywych topnienia zostało opracowanych przed pojawieniem się firmy Omicron, które są ukierunkowane na mutację N501Y białka SARS-CoV-2 S, dając negatywne wyniki dla próbek wariantu Omicron, prawdopodobnie z powodu mutacji otaczających aminokwas 501. Co więcej, Omicron niedawno pojawiły się podwarianty BA.4 i Omicron BA.5 niosą ze sobą pewien wzór mutacji, którego nie oczekuje oprogramowanie przesiewowe, co zapewnia, że ​​stale zmieniające się znaczniki muszą być aktualizowane.

Dodając do wyzwań związanych z nadzorem genetycznym SARS-CoV-2, mutacja A67V umożliwia odróżnienie wariantu Omicron BA.1 od podwariantów Omicron BA.4/5; Jednak podzmienna Omicron BA.4 i podzmienna Omicron BA.5 mają podobne profile genów w miejscu 69/70del, a zatem potrzeba więcej celów dla testów vsPCR, aby odróżnić podwarianty Omicron.

*Ważna uwaga

Research Square publikuje podstawowe doniesienia naukowe, które nie zostały zrecenzowane, a zatem nie powinny być uznawane za rozstrzygające lub ukierunkowujące praktykę kliniczną/zachowania związane ze zdrowiem lub traktowane jako ustalone informacje.