Wpływ mutacji dodatkowych białek i innych rozregulowanych mutacji na patogenezę SARS-CoV-2

Pandemia nowego koronawirusa 2019 (COVID-19) zabiła ponad sześć milionów z prawie 500 milionów przypadków – mimo że dziesiątki milionów zostało nieudokumentowanych i niezdiagnozowanych. Czynnikiem sprawczym jest koronawirus 2 (SARS-CoV-2), który pojawił się w grudniu 2019 r. w Wuhan, zanim rozprzestrzenił się na wszystkie części świata.

Wirus zmutował w wiele gatunków, niektóre z większą patogennością i/lub cechami unikania odporności. Nowa wstępna wersja bada udział tych mutacji w patogenezie i przenoszeniu wirusa.

wstęp

SARS-CoV-2 zawiera genom RNA złożony z otwartych ramek odczytu (ORF), które kodują białka homologiczne, białka strukturalne i dodatkowe białka. Gen homologiczny znajduje się na końcu 5 przez ORF1a/b, po którym następują cztery geny strukturalne kolca, otoczki, błony i nukleokapsydu wirusa.

Wśród tych genów znajdują się dodatkowe białka, które są unikalne dla każdej rodziny wirusów. W ten czy inny sposób przyczyniają się one do patogenezy COVID-19. Na przykład szlak sygnałowy interferonu wyzwala odpowiedzi przeciwwirusowe i/lub zapalne.

Jednak SARS-CoV-2 ORF3b inaktywuje ten szlak, podczas gdy ORF7a blokuje gen stymulujący interferon (ISG) BST2. Podobnie translokacji białka STAT1 do jądra, napędzanej ekspresją interferonu, który moduluje ekspresję ISG, sprzeciwia się wirusowy ORF6.

Warianty wirusa badano głównie pod kątem nagłych mutacji, ponieważ białko to pośredniczy w wiązaniu wirusa i wejściu do docelowych komórek gospodarza. Kolec oddziałuje z komórką gospodarza za pośrednictwem receptora enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2), który jest antygenem immunologicznym. Mutacje tego genu były w niektórych przypadkach związane z unikaniem odporności.

W aktualnym szkicu preprintu, opublikowanym pod adresem bioRxiv* Server, naukowcy przyjrzeli się roli białek pomocniczych przy użyciu technologii składania genomów syntetycznych. Skupili się na delecjach w ORF3a/b, ORF6, 7a/7b i 8 w rodowym szczepie wirusa, badając najpierw wpływ na zdolność reprodukcyjną in vitro. Następnie przyjrzeli się, jak wpływa na patogenezę zakażenia SARS-CoV-2 w modelu mysim.

Skonstruowali także rekombinowane warianty białek wypustek na szkielecie WA-1. Warianty te zostały dopasowane do wariantów podniesienia poziomu alfa, beta i gamma i porównane z białkiem kolców przodków pod kątem sprawności reprodukcyjnej i patogenezy u myszy.

Co pokazało badanie?

Naukowcy odkryli, że dodatkowe delecje genów ORF3a i ORF3b (WA-1ΔORF3a/b) zmniejszyły zdolność reprodukcyjną wirusa u myszy. Myszy zakażone wirusem delecyjnym nie straciły na wadze tak bardzo jak kontrole zakażone szczepem przodków (WA-1), a obciążenie wirusem w tkankach płuc w dniach 2 i 4 było znacznie niższe. Potwierdza to wcześniejsze badania nad tym usunięciem.

Jednakże, w przeciwieństwie do poprzednich doniesień o osłabionych efektach klinicznych z usunięciem ORF7a, ORF7b i ORF8 u myszy, w obecnych doświadczeniach nie wystąpił żaden wpływ na obciążenie wirusem. Może to wynikać z różnic w dawce zakaźnej lub w różnych szczepach myszy.

WA-1ΔORF3a/b powodował również niższą ekspresję zapalnych cytokin i chemokin w porównaniu z infekcją WA-1, prawdopodobnie z powodu niższych poziomów replikacji. Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowano podobny wpływ na rekrutację neutrofili. Regulacja w górę genów I14 i I15 prowadzi do odpowiedzi komórek pomocniczych T (Th2) typu 2, która występuje w ciężkich postaciach COVID-19.

Jest to niezgodne z mniej ostrym fenotypem klinicznym WA-1ΔORF3a/b. Możliwym wyjaśnieniem regulacji w górę tych cytokin, a nie oczekiwanej regulacji w dół, może być ich związek z naprawą tkanek, która występuje wcześniej u tych myszy ze względu na szybsze usuwanie wirusa.

Adipoq to kolejny gen u tych myszy regulowany w dół, który wiąże się z adiponektyną, hormonem uwrażliwiającym tkanki na działanie insuliny. Niskie poziomy adiponektyny są związane z ostrą niewydolnością oddechową w COVID-19.

Stwierdzono, że warianty wypustek wprowadzone do szkieletu WA-1 nie wykazują znaczących zmian w ich nawrotach, ale miano wirusa, mierzone za pomocą miana wirusa w supernatancie po 72 godzinach, było niższe w przypadku wariantu wypustki gamma niż w przypadku gamma. alternatywny.

Nie znaleziono różnic w utracie wagi, obciążeniu wirusem lub mianie mózgu dla pozostałych dwóch zmiennych podwyższonych na WA-1, w porównaniu z rzeczywistymi zmiennymi, u myszy K18-hACE2. Jednak w przypadku myszy BALB/c szczep Beta spike-WA1 wykazywał słabszy fenotyp w porównaniu z wariantem Beta, podczas gdy w przypadku szczepu Alpha spike-WA1 miano wirusa w płucach wzrosło w 2. dniu bez żadnej różnicy w utracie wagi .

W obu szczepach myszy największą różnicę zaobserwowano w przypadku wariantu gamma spike-WA1 w porównaniu z wariantem gamma, przy czym pierwszy typ wykazywał cięższy fenotyp pod względem utraty wagi i kalibracji płuc niż wariant gamma. U myszy K18-hACE2 wystąpiła tendencja do wyższych mian wirusów w mózgu i wyższych stężeń RNA, bez znaczenia.

Cytokiny płucne i chemokiny również wykazały różnice w dniach 2 i 4, ponownie wyraźniej w szczepie Gamma spike-WA1 niż w szczepie gamma. Najbardziej dotknięte były geny rekrutacji neutrofili, przy czym CXCL5 wykazywał największy wzrost ekspresji. Co ciekawe, ten gen jest główną atrakcją neutrofili w COVID-19 i jest przyczyną stanu zapalnego.

Geny takie jak thpok i I15 zostały obniżone. Ponieważ prowadzą one do różnicowania limfocytów T CD4+, wynik ten może wskazywać, że nierzadkie geny WA-1 hamują ten szlak i że hamowanie to zanika wraz z pełnym wariantem gamma.

Ta ostatnia pokazuje również utratę antagonizmu przeciwwirusowego, w której pośredniczą geny bez kolców, ponieważ myszy zakażone gamma miały wyższy poziom interferonu-gamma w płucach niż myszy gamma z kolcem-WA1. Kontrastuje to z wyższymi mianami w płucach obserwowanymi u tych ostatnich. Jednak ta różnica została spłaszczona już czwartego dnia.

Jakie są efekty?

„Ta praca pokazuje, że ORF3a/b odgrywa nieodłączną rolę w patogenezie i odpowiedziach gospodarza na SARS-CoV-2.. Tak więc mutacje w białkach pomocniczych wariantów wirusa, zwłaszcza ORF3a, wydają się przyczyniać do patogenezy COVID-19 z wariantami.Zarówno wariant beta, jak i gamma miały mutacje ORF3a, a mutacje te są nadal obecne w nowszych wariantach, co wskazuje na ich znaczenie w zdolności do reprodukcji i przenoszenia.

„Interpretujemy te dane, aby wskazać, że mutacje pozakolcowe mogą prowadzić do krytycznych fenotypów infekcji i choroby SARS-CoV-2.. Innymi słowy, nagłe mutacje często zwiększają powinowactwo do ACE, co sprzyja wnikaniu wirusa do komórek i unikaniu odporności, natomiast mutacje uzupełniające zmniejszają nasilenie kliniczne, umożliwiając przedłużoną replikację i zwiększoną transmisję wirusa.

Łącznie może to zapewnić, że wirus będzie nadal dostosowywał się z lepszą zdolnością reprodukcyjną, zdolnością przenoszenia i patogennością.

*Ważna uwaga

bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie podlegają wzajemnej ocenie i dlatego nie powinny być uważane za rozstrzygające, ukierunkowywać praktykę kliniczną/zachowania związane ze zdrowiem lub być traktowane jako ustalone informacje.