Nowa metoda umożliwia obrazowanie sieci sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu standardowych mikroskopów

Obecne techniki obrazowania komórek ograniczają się do jednoczesnego badania kilku różnych typów cząsteczek w komórce. Jednak możliwość lepszego pomiaru sygnałów molekularnych i sposobu, w jaki komórki reagują na nie za pośrednictwem molekularnych sieci sygnalizacyjnych, może pomóc naukowcom dowiedzieć się więcej o funkcjach komórkowych. Teraz badacze opracowali nową metodę, która umożliwia jednoczesne monitorowanie co najmniej siedmiu różnych cząsteczek.

Praca ta została opublikowana w komórka W papierze „Czasowe obrazowanie multipleksowe dynamicznych sieci sygnalizacyjnych w żywych komórkach.„

„W biologii istnieje wiele przykładów, w których jedno zdarzenie uruchamia długi łańcuch zdarzeń, który następnie prowadzi do określonej funkcji komórkowej” – powiedział dr Edward Boyden, profesor inżynierii biologicznej oraz nauk o mózgu i kognitywistyce w MIT oraz Lekarz Howard Hughes. . Jest pracownikiem naukowym tego instytutu, członkiem McGovern Institute for Brain Research w MIT i Kocha Institute for Integrative Cancer Research, a także współdyrektorem Centrum Bioniki K-Lisa Yang. „Jak to się dzieje? Jest to prawdopodobnie jeden z podstawowych problemów w biologii, więc zastanawialiśmy się, czy można po prostu obserwować, jak to się dzieje?”

W nowym podejściu wykorzystuje się zielone lub czerwone cząsteczki fluorescencyjne, które włączają się i gaśnie z różną szybkością. Obrazując komórkę w ciągu kilku sekund, minut lub godzin i wyodrębniając każdy sygnał fluorescencyjny za pomocą algorytmu matematycznego, można śledzić ilość każdego docelowego białka i jego zmiany w czasie.

„Idealnie byłoby, gdybyś mógł obserwować wahania sygnałów w komórce w czasie rzeczywistym, a następnie zrozumieć, w jaki sposób są ze sobą powiązane. To powie ci, jak komórka wykonuje obliczenia” – powiedział Boyden. Problem w tym, że nie można oglądać wielu rzeczy jednocześnie.”

W 2020 roku laboratorium Boydena opracowało sposób jednoczesnego obrazowania maksymalnie pięciu różnych cząsteczek wewnątrz komórki, poprzez kierowanie reporterów fluorescencyjnych w różne miejsca wewnątrz komórki. Ten Podejście multipleksowania przestrzennego Umożliwia badaczom rozróżnienie sygnałów pochodzących od różnych cząsteczek, nawet jeśli wszystkie mogą fluoryzować w tym samym kolorze.

W nowym badaniu naukowcy stworzyli „przełączalne fluorofory”, czyli białka fluorescencyjne, które włączają się i wyłączają z określoną szybkością. Każdy z tych przełączalnych fluoroforów można wykorzystać do znakowania innego rodzaju cząsteczki w żywej komórce. Po obrazowaniu komórki przez kilka minut, godzin, a nawet dni, badacze wykorzystują algorytm matematyczny do wybrania konkretnego sygnału z każdego fluoroforu, w podobny sposób, w jaki ludzkie ucho odbiera dźwięki o różnych częstotliwościach.

„W orkiestrze symfonicznej masz instrumenty o wysokim tonie, jak flet i instrumenty o niskim tonie, jak tuba. A pośrodku są instrumenty, jak trąbka. Każdy z nich wydaje inny dźwięk, a nasze uszy je sortują, – powiedział Boyden.

Następnie badacze wykorzystali liniową dekonwolucję do analizy sygnałów fluoroforów. Metodą tą można wyodrębnić różne sygnały fluoroforowe. Po zakończeniu tej analizy badacze mogą sprawdzić, kiedy i gdzie w komórce znaleziono każdą z wyznakowanych fluorescencyjnie cząsteczek podczas całego okresu obrazowania. Samo obrazowanie można wykonać za pomocą prostego mikroskopu optycznego, bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.

Naukowcy zademonstrowali swoje podejście, oznaczając sześć różnych cząsteczek biorących udział w cyklu podziału komórkowego w komórkach ssaków. Pozwoliło im to zidentyfikować wzorce zmian poziomów enzymów zwanych kinazami zależnymi od cyklin w miarę przechodzenia komórki przez cykl komórkowy.

Naukowcy wykazali również, że potrafią klasyfikować inne typy kinaz, które biorą udział w niemal każdym aspekcie sygnalizacji komórkowej, a także w strukturach komórkowych i organellach, takich jak cytoszkielet i mitochondria. Ponadto naukowcy wykazali, że technika ta może działać w mózgach larw danio pręgowanego.

Zdaniem naukowców metoda ta może być przydatna do monitorowania reakcji komórek na wszelkiego rodzaju bodźce, takie jak składniki odżywcze, czynniki układu odpornościowego, hormony czy neuroprzekaźniki. Można go również wykorzystać do badania reakcji komórek na zmiany w ekspresji genów lub mutacje genetyczne. Wszystkie te czynniki odgrywają ważną rolę w zjawiskach biologicznych, takich jak rozwój, starzenie się, nowotwory, neurodegeneracja i tworzenie pamięci.

„Można myśleć o wszystkich tych zjawiskach jako o ogólnej klasie problemów biologicznych, w których krótkotrwałe wydarzenie – takie jak zjedzenie składnika odżywczego, nauczenie się czegoś lub zarażenie się – powoduje długoterminową zmianę” – powiedział Boyden.

Oprócz prowadzenia tego typu badań laboratorium Boydena pracuje również nad rozszerzeniem repozytorium przełączalnych fluoroforów, aby móc badać więcej sygnałów w komórce. Mają też nadzieję dostosować system tak, aby można go było zastosować w modelach myszy.